念念不忘，必有回響~繼如何做好逆轉(zhuǎn)錄PCR（一）——影響逆轉(zhuǎn)錄的重要因素（往期微信鏈接）后，小達(dá)君又來繼續(xù)跟您叨叨逆轉(zhuǎn)錄PCR那點(diǎn)兒事了——如何提高RT-PCR的特異性。

一、引物選擇

cDNA第一鏈合成的起始可以使用三種不同的方法：隨機(jī)引物法、oligo（dT）引物法和基因特異性引物法。各種方法的相對特異性影響了合成的cDNA的量和種類,特異性低的引物，合成的cDNA的量會比較大，種類也比較雜。

(一)隨機(jī)引物法

隨機(jī)引物是堿基序列具有隨機(jī)性的寡核苷酸，其長度通常為6個核苷酸，能夠與樣品中所有類型的RNA結(jié)合。當(dāng)特定的mRNA由于含有使反轉(zhuǎn)錄酶終止的序列而難以拷貝全長序列時，可采用隨機(jī)引物來拷貝全長mRNA。隨機(jī)引物法是三種方法中特異性最低的。使用此方法時，體系中所有的RNA分子都充當(dāng)了合成cDNA第一鏈的模板，合成的cDNA中96%來源于rRNA。

(二)Oligo(dT)法

Oligo（dT）引物由12-18個脫氧胸腺核苷酸組成，能夠與真核mRNA的Poly(A)尾部相結(jié)合。這種引物適用于以真核mRNA為模板構(gòu)建cDNA文庫、全長cDNA克隆，不適用于以降解的RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。由于Poly(A) RNA僅占總RNA 的1-5%， 故這種引物合成的cDNA比隨機(jī)引物法得到的cDNA在數(shù)量和復(fù)雜性方面均要小。這種方法比隨機(jī)引物的特異性高。

(三)特異性引物法

特異性引物法是特異性最高的一種方法，該方法中的引物含有與目標(biāo)RNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸，用此類引物僅合成所需的cDNA。

二、提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度

較高的保溫溫度有助于RNA二級結(jié)構(gòu)的打開。對于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級結(jié)構(gòu)，從而使兩者可以結(jié)合。然而，某些模板仍然會存在二級結(jié)構(gòu)，即使熱變性后也是如此。較高的保溫溫度可以提高特異性，尤其在使用基因特異性引物進(jìn)行cDNA合成時。

三、使用具有較高熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶

熱穩(wěn)定逆轉(zhuǎn)錄酶可以在較高溫度下保溫，以提高cDNA合成的特異性。舉個栗子，如果一個基因特異性引物（GSP）的退火溫度為55℃，那么使用AMV或M-MLV在37℃進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，GSP所帶有的特異性就沒有完全利用。然而， 某些具有強(qiáng)熱穩(wěn)定性的逆轉(zhuǎn)錄酶可以在50℃或者更高的溫度下進(jìn)行反應(yīng)，這就會消除較低溫度時產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物。

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