自噬通過(guò)溶酶體將胞漿物質(zhì)降解，是維持恒定程序的基本要素。研究自噬潮（autophagicflux）的關(guān)鍵蛋白是LC3（微管相關(guān)蛋白1輕鏈3）。在分離膜形成時(shí)胞漿中的LC3被招募并進(jìn)入自噬程序，此定位動(dòng)作被視為自噬膜的特征，用以檢測(cè)自噬的生成和發(fā)展。由LC3B融合一個(gè)綠色熒光蛋白（GFP）和一個(gè)紅色熒光蛋白（RFP）組成的嵌合蛋白 ，是檢測(cè)自噬過(guò)程的簡(jiǎn)單方法。自噬體的形成可被RFP-GFP-LC3標(biāo)記，顯示RFP和GFP雙信號(hào)。與溶酶體融合后，酸性環(huán)境可顯著降低GFP信號(hào)，RFP信號(hào)卻保持穩(wěn)定。隨著自噬研究熱度的不斷提高，自噬報(bào)告基因細(xì)胞作為自噬過(guò)程研究的工具越來(lái)越多的受到廣大科研工作者的關(guān)注。

InvivoGen對(duì)人上皮瘤細(xì)胞系Hela、鼠源巨噬細(xì)胞系RAW264.7和人源單細(xì)胞系THP-1進(jìn)行基因改造，在人源或鼠源LC3的N末端融合兩個(gè)熒光蛋白，RFP（酸性穩(wěn)定）和GFP（酸性敏感），得到了穩(wěn)定表達(dá)RFP:GFP:LC3的報(bào)告基因細(xì)胞Hela-DiFluo^TMhLC3細(xì)胞、RAW-DiFluo^TMhLC3細(xì)胞和THP1-DiFluo^TMhLC3細(xì)胞。在這些報(bào)告基因細(xì)胞中，通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)綠色GFP-LC3和（或）紅色RFP-LC3斑點(diǎn)的呈現(xiàn)狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)RFP-GFP搭配實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)自噬潮的功能。

在自噬的早期，RFP和GFP信號(hào)均可被探知，當(dāng)進(jìn)入自噬體和溶酶體融合程序，GFP熒光信號(hào)消失，只留下可視的RFP熒光信號(hào)。GFP-LC3/RFP-LC3陽(yáng)性細(xì)胞和RFP-LC3陽(yáng)性細(xì)胞的比例可用來(lái)評(píng)估自噬潮的階段。

Hela-DiFluo^TMhLC3細(xì)胞、RAW-DiFluo^TMhLC3細(xì)胞和THP1-DiFluo^TMhLC3細(xì)胞均有Zeocin^TM抗性。

△圖1. 在HeLa-DiFluo hLC3 cells中檢測(cè)熒光斑點(diǎn)

☆HeLa-Difluo?hLC3細(xì)胞被25μM rapamycin 單獨(dú)處理或25μM rapamycin和 500nM bafilomycin A1（抑制自噬體和溶酶體融合）聯(lián)合處理。孵育24小時(shí)，用2% PFA固定細(xì)胞，并用共聚焦顯微鏡分析結(jié)果。請(qǐng)注意在圖片viii中，黃色（自噬體）和紅色（自噬溶酶體）斑點(diǎn)均顯著提升，而圖片ix中的斑點(diǎn)幾乎均為黃色（自噬體）。

相關(guān)產(chǎn)品：

InvivoGen 1977年成立于法國(guó)，是法國(guó)較早的生物科技公司。公司成立的初期階段主要提供細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑，如抗支原體、細(xì)菌、真菌污染的抗生素以及基因篩選抗生素（Blasticidin, Puromycin, Hygromycin B, G418, Zeocin）。隨著天然免疫研究熱點(diǎn)的興起，InvivoGen于2000年開(kāi)始致力于天然免疫相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)，并成為全世界優(yōu)質(zhì)、專(zhuān)業(yè)的天然免疫相關(guān)產(chǎn)品生產(chǎn)商。InvivoGen為天然免疫研究提供一整套研究方案，包括不斷更新的模式識(shí)別受體（PRRs）激動(dòng)劑和拮抗劑，PRRs報(bào)告基因細(xì)胞以及天然免疫信號(hào)通路的誘導(dǎo)劑和抑制劑等。

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