流式細(xì)胞儀是通過內(nèi)置的激光器發(fā)射激光激發(fā)熒光染料，即被488nm或其它特定波長的光激發(fā)后，發(fā)射出另一特定波長的發(fā)射光，并通過光電倍增管或光電二極管將光信號放大轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柣驍?shù)字信號，并由計算機(jī)統(tǒng)計處理為可讀數(shù)據(jù)。

用激光束激發(fā)兩種或兩種以上熒光染料而發(fā)出不同波長的熒光，從理論上講，可以選擇光學(xué)組件將它們分開，僅使一種熒光被一種熒光探測器收集處理，而檢測不到另外一種熒光。但實際上由于熒光素的發(fā)射波長是正態(tài)或偏正態(tài)曲線，即有很寬的范圍，熒光素之間的波譜常有重疊現(xiàn)象，如下圖1-1所示。由此，我們需要進(jìn)行補償調(diào)節(jié)，補償?shù)膹姸葘㈦S著各熒光探測器的放大倍數(shù)（電壓）的變化而變化，特定的電壓對應(yīng)特定的補償參數(shù)。

圖1-1  FITC和PE發(fā)射光譜

對于熒光補償?shù)拇_定，需運用以上補償?shù)幕驹聿⒔Y(jié)合特定的標(biāo)本來實現(xiàn)。以FITC,PE雙色分析為例：

（1）先調(diào)節(jié)陰性對照管：將原補償清零，首先調(diào)節(jié)電壓，通過調(diào)節(jié)電壓，使陰性群落在FITC和PE雙陰性區(qū)。

（2）FITC單染管：在理想情況下（沒有熒光干擾），因檢測管中不應(yīng)該出現(xiàn)PE信號，但實際情況是在FITC與PE的雙陽性區(qū)出現(xiàn)了熒光信號。這個信號就是PE探測器檢測到的FITC信號。此時需要通過調(diào)節(jié)補償參數(shù)，取合適的補償強度來抵消PE中的信號。如下圖所示，調(diào)節(jié)補償（PE- %FITC ),使得兩群細(xì)胞FL2的Mean/Median值相同或相近，或通過經(jīng)驗判斷（原則為“橫平，豎直”）。當(dāng)PE探測器檢測到的FITC信號恰好完全消除時，即PE信號與陰性對照一樣時，PE對FITC的補償調(diào)節(jié)完成。

（3）PE單染管：同理，將進(jìn)入FITC探測器的PE信號通過補償調(diào)節(jié)來消除。 

（4）當(dāng)設(shè)置好以上補償條件后，即補償調(diào)節(jié)完畢。

圖1-2 FITC和PE通道補償調(diào)節(jié)

圖1-3 補償不足和過補償?shù)碾p參數(shù)點圖

補償調(diào)節(jié)抗體的正確選擇對于熒光通道之間的補償調(diào)節(jié)是非常重要的。要求選擇的抗體所結(jié)合的抗原分子在樣本細(xì)胞中有明確表達(dá)，占樣品細(xì)胞的10%以上，50%以下。如果陽性細(xì)胞比例太低，在陽性細(xì)胞區(qū)域無法形成明顯的細(xì)胞團(tuán)，無法判斷調(diào)節(jié)是否合適。如陽性細(xì)胞比例過高，則不表達(dá)該抗原的陰性細(xì)胞無法形成明顯的細(xì)胞團(tuán)，如圖1-4直方圖所示。

圖1-4直方圖

更多學(xué)習(xí)資料請參閱達(dá)科為生物商城：/

達(dá)科為生物商城—技術(shù)天地—技術(shù)專欄—流式技術(shù)