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ELISPOT斑點(diǎn)的特征

作者:admin 信息來源:達(dá)科為 日期:20130830 打印 字體:  
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    “一個(gè)陽性細(xì)胞,對應(yīng)一個(gè)ELISPOT斑點(diǎn)”,這是ELISPOT檢測的理論前提。無數(shù)的實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)?,F(xiàn)有的抗體技術(shù)以及酶聯(lián)放大技術(shù)確實(shí)可以把單個(gè)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的行為記錄下來,ELISPOT板上的每一個(gè)斑點(diǎn)就是好的證明。下面我們來看一看ELISPOT斑點(diǎn)的特征。


    圓形,有暈核結(jié)構(gòu)


    這是判定真假ELISPOT斑點(diǎn)的主要標(biāo)準(zhǔn)。ELISPOT斑點(diǎn)有

這種結(jié)構(gòu)可以從幾何學(xué)的原理得到很好的理解和解釋(如圖

1.2所示)。懸浮在ELISPOT板膜上的細(xì)胞,它分泌細(xì)胞因子

是沒有方向性的,均勻地向四面八方擴(kuò)散,如果擴(kuò)散到

ELISPOT板膜,就會(huì)被板膜上的包被抗體捕獲。在所有從細(xì)胞到斑膜的路徑中,有條路徑短,這就是位于細(xì)胞正下方到板膜的垂直距離。路徑越短,擴(kuò)散中耗散損失就越少,到達(dá)該點(diǎn)的細(xì)胞因子就越多,將來顯色的時(shí)候顏色就越深。以垂直距離點(diǎn)為圓心,向外畫一系列的同心圓,同心圓的直徑越大,細(xì)胞因子擴(kuò)散的距離就越長,耗散越多,到達(dá)的細(xì)胞因子就越少,顏色就越淺。當(dāng)超過一定距離之后,擴(kuò)散到達(dá)的細(xì)胞因子就減少到背景水平了,這就是斑點(diǎn)的邊界。


    大小不均一,正態(tài)分布


    ELISPOT斑點(diǎn)要比產(chǎn)生它的那個(gè)細(xì)胞大很多。我們知道,

哺乳動(dòng)物細(xì)胞的直徑約是5-10μm,而ELISPOT斑點(diǎn)的直徑通常是50-150μm,比細(xì)胞大10倍以上。

    同一類陽性細(xì)胞,受到相同的刺激,產(chǎn)生的斑點(diǎn)大小也不完全相同。這些斑點(diǎn)大小不一,但是如果把它們的直徑統(tǒng)計(jì)出來,這發(fā)現(xiàn)它們呈正態(tài)分布的,見圖1.3。
    需要說明的是,不同的細(xì)胞,對不同的刺激物,不同的細(xì)胞因子,ELISPOT斑點(diǎn)的直徑(平均直徑)也不同。通常來說,T細(xì)胞產(chǎn)生的斑點(diǎn)較大,單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的斑點(diǎn)小;特異性的抗原(多肽或者蛋白)刺激產(chǎn)生的斑點(diǎn)大,非特異性的有絲分裂原(PHA、ConA等)刺激產(chǎn)生的斑點(diǎn)??;IFN-γ、IL-4等細(xì)胞因子的斑點(diǎn)大,IL-10、IL-12、Granzyme B之類的細(xì)胞因子的斑點(diǎn)小。
    如果一次實(shí)驗(yàn)中有兩類細(xì)胞同時(shí)受到刺激,比如T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞,或者一次實(shí)驗(yàn)中T細(xì)胞受到兩種不同的刺激物刺激,比如蛋白抗原與內(nèi)毒素(大腸桿菌表達(dá)的蛋白很可能含有較高濃度的內(nèi)毒素),那么同一個(gè)孔中就會(huì)出現(xiàn)兩種不同的斑點(diǎn)。這兩種斑點(diǎn)用肉眼很難區(qū)別,但是如果對它們直徑分布做統(tǒng)計(jì)作圖的話,就會(huì)有別于圖1.3中的單峰分布,而是呈現(xiàn)雙峰分布。
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