1．紫外消毒30min后關(guān)閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態(tài)，用酒精消毒操作者的雙手。

2．將所需的培養(yǎng)基確保瓶身干凈后放于工作臺面內(nèi)，點燃酒精燈，將培養(yǎng)基瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側(cè)。特別是將培養(yǎng)基瓶放于斜架上，瓶口對準(zhǔn)酒精燈，且放在距離酒精燈近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側(cè)。

3. 將培養(yǎng)瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，瓶蓋放于酒精燈右側(cè)后將培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液懸空倒進(jìn)污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，

4．拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進(jìn)入培養(yǎng)基瓶內(nèi)吸取4ml培養(yǎng)基再懸空移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶瓶口和瓶蓋在酒精燈上消毒2-3次后擰緊平放。

5．將培養(yǎng)基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關(guān)閉超凈工作臺。

6. 將培養(yǎng)瓶放于28℃,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，旋開瓶口少許。

   每天定時觀察細(xì)胞生長情況，一般72-96h后，細(xì)胞生長密度大于90%，即可進(jìn)行細(xì)胞的傳代。