否！滾去學(xué)習(xí)！

今天小達(dá)君就帶大家學(xué)習(xí)一波sao酷炫操作：同時(shí)獲得單細(xì)胞mRNA和表面抗原信息。絕對(duì)是熬夜也要學(xué)會(huì)的新技能哦～

我們先來(lái)看看單細(xì)胞測(cè)序（Single-cell sequencing）

普通測(cè)序所提取的RNA（或DNA）源于樣本中的多個(gè)細(xì)胞，得到的RNA信息是混雜在一起的，所以沒(méi)辦法鑒別不同細(xì)胞間存在的異質(zhì)性（Heterogeneity），而很多發(fā)育過(guò)程或者疾病發(fā)生等往往是與一些特定細(xì)胞的作用有關(guān)，這個(gè)時(shí)候普通測(cè)序就不能研究這些特定的單個(gè)細(xì)胞發(fā)揮的巨大作用；而單細(xì)胞測(cè)序則是針對(duì)單個(gè)細(xì)胞的基因組進(jìn)行測(cè)序，能夠更好地幫助我們認(rèn)識(shí)細(xì)胞與細(xì)胞之間的差異。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)自2009年問(wèn)世，2013年被Nature Methods評(píng)為年度技術(shù)以來(lái)，越來(lái)越多地被應(yīng)用在科研領(lǐng)域：腫瘤異質(zhì)性研究、個(gè)體發(fā)育、干細(xì)胞研究、新細(xì)胞與稀有細(xì)胞亞型的鑒定等。

新冠肺炎爆發(fā)至今，已經(jīng)有多篇單細(xì)胞測(cè)序助力新冠肺炎致病機(jī)理研究和治療方案探索的文章。同濟(jì)大學(xué)左為團(tuán)隊(duì)利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)人體肺臟內(nèi)每一個(gè)細(xì)胞的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，研究表明，ACE2受體的表達(dá)主要集中在肺內(nèi)一小群II型肺泡上皮細(xì)胞(AT2)上¹；浙江大學(xué)鄭敏團(tuán)隊(duì)等也利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)分析了呼吸道不同位置組織中的ACE2 RNA表達(dá)譜，結(jié)果表明ACE2在鼻上皮細(xì)胞中也表達(dá)，說(shuō)明鼻腔也可能是病毒感染侵襲的重要器官²。

在新冠治療方案探索中，單細(xì)胞測(cè)序也貢獻(xiàn)了巨大的力量：北京大學(xué)BIOPIC/ICG等單位用高通量單細(xì)胞測(cè)序分析新冠病毒康復(fù)者體內(nèi)B細(xì)胞VDJ基因重排生成的抗體，找到了新冠肺炎多種全人源抗體³; 然后是上海大學(xué)等單位的研究表明MSCs移植治療新冠肺炎具有安全性和有效性，能夠緩解病人癥狀，改善肺部炎癥。同時(shí)他們利用10X單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)移植的MSCs進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)MSCs呈ACE2或TMPRSS2陰性，不被COVID-19感染；MSCs高表達(dá)抗炎因子和營(yíng)養(yǎng)因子，進(jìn)一步證實(shí)MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能；MSCs高表達(dá)SPA和SPC，提示MSCs極有可能分化成肺部AT2細(xì)胞；MSCs表達(dá)抗病毒通路的基因⁴。

以上提到的例子只是單細(xì)胞測(cè)序展現(xiàn)的迷人一角，別著急，小達(dá)君還有洪荒之力沒(méi)有使出來(lái)呢：同時(shí)獲得單細(xì)胞mRNA和表面抗原信息

隨著單細(xì)胞RNA測(cè)序的發(fā)展，單純的 mRNA 的信息對(duì)研究人員來(lái)說(shuō)已經(jīng)不能滿(mǎn)足他們的需求，在2017年 Peterson,et. al ⁵ 及 Stoeckius, et. al ⁶  通過(guò)偶聯(lián)在抗體上的 oligo 序列（標(biāo)簽抗體），獨(dú)創(chuàng)性地利用 10X Genomics 平臺(tái)獲取細(xì)胞表面抗原的信息，并且是真正意義上的獲取了同一個(gè)細(xì)胞的 mRNA 和蛋白信息。2019年，Nature Method將單細(xì)胞多模態(tài)組學(xué)（Single Cell Multimodal Omics）評(píng)選為年度技術(shù)，同時(shí)獲得單細(xì)胞mRNA和表面抗原信息也是單細(xì)胞多模態(tài)組學(xué)的一種， 1+1>2 是這項(xiàng)技術(shù)最迷人的地方。

Biolegend利用這項(xiàng)技術(shù)研發(fā)的抗體上連接的這段oligo由3部分組成，第一部分是一段PCR handle序列，它是匹配二代測(cè)序平臺(tái)的擴(kuò)增模板；第二部分是一段Antibody Barcode，一段15nt的特異性序列，唯一barcode和唯一抗體克隆號(hào)對(duì)應(yīng)；第三部分是捕獲序列，與GEL beads或capture beads上的oligo序列互補(bǔ)配對(duì)，使得抗體上的oligo可以被beads所捕獲。而TotalSeq?-A設(shè)計(jì)用于依賴(lài)poly-dT作為mRNA捕獲的方法的單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)，如10X Genomics；TotalSeq?-B是與10X Genomics公司最新Single Cell Gene Expression (3’ v3)相兼容，而TotalSeq?-C抗體是與10X Genomics公司的Single Cell ImmuneProfiling (5’)相兼容。

小達(dá)君感覺(jué)大家被這個(gè)超大的招砸的有點(diǎn)懵。來(lái)來(lái)來(lái)，小板凳準(zhǔn)備好，小達(dá)君給大家扒一扒這種同時(shí)獲得單細(xì)胞mRNA和表面抗原信息的新技術(shù)到底有哪些優(yōu)勢(shì)：

在單細(xì)胞RNA測(cè)序中，盡管有的細(xì)胞表達(dá)了相應(yīng)的mRNA，但是無(wú)法被單細(xì)胞mRNA測(cè)序所檢測(cè)到，但是假如加上標(biāo)簽抗體之后，可以識(shí)別細(xì)胞表面的蛋白，改善dropout現(xiàn)象⁶。

僅僅通過(guò)mRNA的數(shù)據(jù)將PBMC細(xì)胞進(jìn)行聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)其中某些轉(zhuǎn)錄本相似的群體之間，難以區(qū)分（圖A）；加上抗體標(biāo)簽的信息之后，CD4⁺細(xì)胞和CD8⁺細(xì)胞之間的分群得到改善。并且CD4細(xì)胞亞群之間的區(qū)分度更高（圖B）。

常規(guī)的多色流式細(xì)胞術(shù)，可以同時(shí)檢測(cè)20+抗體，它的發(fā)展受限于不同熒光素之間的補(bǔ)償；較新的技術(shù)，比如光譜流式及質(zhì)譜流式，通過(guò)全光譜解析或者金屬離子偶聯(lián)代替熒光基團(tuán)，可以同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞上30+甚至40+的指標(biāo)，但是他們也受限于熒光素和金屬離子的種類(lèi)；但是TotalSeq?的抗體就不一樣了， 由15個(gè)堿基組成的Antibody Barcode理論上的組合數(shù)遠(yuǎn)大于現(xiàn)有抗體的數(shù)。Stoeckius et al 在文章中使用了14個(gè)抗體的組合，Peterson et al在文章中使用了82個(gè)抗體，BioLegend在廠內(nèi)做了單個(gè)細(xì)胞上220個(gè)抗體的組合實(shí)驗(yàn)！現(xiàn)在限制單細(xì)胞表面抗原檢測(cè)的不再是熒光素的種類(lèi)，而是現(xiàn)有抗體的種類(lèi)！

TotalSeq?  Human TBNK Cocktail是BioLegend專(zhuān)門(mén)為單細(xì)胞測(cè)序設(shè)計(jì)的panel。這些凍干的抗體方便使用，且已經(jīng)根據(jù)人PBMC預(yù)先優(yōu)化并滴定濃度，并且按照1test/支進(jìn)行包裝，可以直接使用。

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參考文獻(xiàn)

1. Yu Zhao, et al. Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCoV.BioRxiv.Jan.26,2020.

2. Chao Wu et al. Single-cell RNA expression profiling of ACE2, the putative receptor of Wuhan 2019-nCoV, in the nasal tissue. medRxiv 2020.02.11.20022228.

3. https://biopic.pku.edu.cn/zxdt/501497.htm

4. Zikuan Leng, et al. Transplantation of ACE2- Mesenchymal Stem Cells Improves the Outcome of Patients with COVID-19 Pneumonia. Aging and disease, DOI: 10.14336/AD.2020.0228

5. Peterson VM, et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nat Biotechnol. 2017;35(10):936-939

6. Stoeckius M, et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nat Methods. 2017;14(9):865-868